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本發(fā)明涉及一種通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)快速獲得大片段缺失的細(xì)胞系基因敲除方法，屬于基因工程和遺傳修飾領(lǐng)域。本發(fā)明改造pX458載體，使其帶有DsRed2和ECFP，然后針對(duì)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)多個(gè)特異性的sgRNA位點(diǎn)，將其連接至改造載體中，轉(zhuǎn)染細(xì)胞系后利用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞群進(jìn)行分選，可以非?？焖佾@得基因組被編輯的單細(xì)胞，然后用PCR擴(kuò)增單細(xì)胞DNA序列，通過(guò)凝膠電泳即可以從中挑選出具有大片段缺失的單細(xì)胞。本發(fā)明通過(guò)將CRISPR/Cas9系統(tǒng)、流式細(xì)胞儀單細(xì)胞分選和表達(dá)載體上的熒光蛋白篩選三者結(jié)合起來(lái)，可以在短時(shí)間內(nèi)獲得具有大片段缺失的陽(yáng)性單克隆，極大地提高細(xì)胞系基因敲除工作效率。

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